MM_FS_CNJ_0074 出口禽肉中杆菌肽酚残留量检验方法

MM_FS_CNJ_0074出口 禽肉 杆菌肽酚 残留量 杯碟法

MM_FS_CNJ_0074

      出口禽肉中杆菌肽酚残留量检验方法

1.适用范围

    本方法适用于出口冻鸡中杆菌肽残留量的检验。

2.原理概要

    用33%吡啶溶液提取试样中杆菌肽，将提取液再用甲醇提取，经减压浓缩至干，用磷酸盐缓冲液溶解残留物，调整pH后用杯碟法测定。

3.主要试剂和仪器

3.1.主要试剂

    吡啶：分析纯；

    吡啶溶液：33%。取吡啶33mL，用蒸馏水定容至100mL；

    甲醇：分析纯；

    磷酸盐缓冲液：5%，pH 6.5。称取22.15g无水磷酸氢二钾和27.85g无水磷酸二氢钾溶解于蒸馏水中，定容至1 000mL；

    氢氧化钠溶液：1mol/L；

    磷酸盐缓冲液：1%，pH 6.0。称取2.0g无水磷酸氢二钾和8.0g无水磷酸二氢钾溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；

    杆菌肽标准品：58 IU/mg(卫生部药品生物制品检定所提供)；

    试验菌种：藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)，菌种号28008(卫生部药品生物制品检定所提供)；

    培养基

    增菌用培养基：见附录A第A1章；

    基层用培养基：见附录A第A2章；

    菌种层用培养基：见附录A第A3章。

3.2.仪器

    培养皿：内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，并应配有陶瓦盖；

    牛津杯：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10±0.1mm，不锈钢管；

    游标卡尺：测量范围0～200mm，精度0.02mm，或使用抑菌圈测量仪测量；

    离心机：转速3000r/min；

    旋转式真空浓缩器；

    恒温培养箱：36±1℃；

    高压灭菌器；

    其他：玻璃板，吸管，滴管，茄形瓶等。

4.试样的抽取与制备

4.1.检验批

    以不超过2500件商品为一检验批。

    同一检验批的商品应具有相同特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。

4.2.抽样数量

4.3.抽样方法

    按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，原始样品总量不少于2kg，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。

4.4.样品制备

    从每袋原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入绞碎机中绞碎均匀，充分混匀，用四分法缩分不少于1kg试样。装入清洁容器内，加封后，标明标记。

4.5.样品保存

    将试样于－18℃冷冻保存。

注：在抽样及制样过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

5.过程简述

5.1.工作液制备

5.1.1.杆菌肽标准贮备液

    准确称取适量的杆菌肽标准品，用1% pH6.0磷酸盐缓冲液配制成100IU/mL的标准贮备液，于冰箱中保存，可使用一周。

5.1.2.杆菌肽标准工作液

    吸取一定量杆菌肽标准贮备液，用1% pH6.0磷酸盐缓冲液稀释成0.15和0.6 IU/mL的工作标准液，以及0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 IU/mL的稀释液，作为制备标准曲线的标准浓度溶液，0.100 IU/mL的稀释液为参考浓度溶液。以上稀释液均须当日配制。

5.1.3.菌种培养及菌液的制备

    将试验菌种安瓿瓶上部消毒后敲碎，加入少量增菌用培养基溶解后，移入以上培养基中，混匀后于36±1℃培养24h，再转接至琼脂试管斜面，培养16～18h，然后加入适量生理盐水，将菌苔洗下，备用。

5.2.试液制备：准确称取经绞碎混匀的试样10.0g于均质器内，加入17mL吡啶溶液(33%)，均质3min后，移入离心管中离心20min(3000r/min)。取上清液10mL，置于另一个离心管内，加入30mL甲醇充分振摇2min，再离心20min(3000r/min)。将上清液移入茄形瓶中，减压浓缩至干，加入3mL磷酸盐缓冲液(5%)溶解即为样液。此样液中相当于禽肉试样浓度为1.96g/mL。

5.3.测定

5.3.1.平板制备

    于无菌平皿中加入20mL熔化的基层用培养基，保持水平，待其凝固备用。然后，将锥形瓶中菌种层用培基经熔化并冷却至50～55℃，加入适量的试验菌液使之充分混合后，取4mL注入上述基层培养基上，保持水平，待其凝固。在测定前应先用0.15IU/mL标准工作液对该菌液浓度的平板进行预测试，经培养后其标准工作液所呈现的抑菌圈直径在10mm以上，则该菌液浓度的平板即可使用，否则须调整其菌液浓度，制成合于检定用的平板。

5.3.2.标准曲线的制备

    可参照SN 0179—92中的6.1。

5.3.3.检测

    每个样品用三个检定平板，在每个平板上，如不需定量时，置4只消毒的牛津杯，对角2只注满样液，剩余的2只杯里分别注满0.6IU/mL和0.15IU/mL杯菌肽标准工作液；如需定量时，须置6只消毒的牛津杯，间隔注满样液和0.1IU/mL杆菌肽标准工作液，于36±1℃培养17±1h。

6.结果计算

6.1.结果计算和表述

    在三个检定平板上，如样液呈出与0.6IU/mL和0.15IU/mL标准工作液相同的清晰抑菌圈时，可用游标卡尺或测量仪进行测量，其抑菌圈平均直径在10mm以上者为阳性。

    对于需定量的实验结果，将分别算出三个检定平板上0.1 IU/mL和样液的抑菌圈直径的平均值，经校正后，于标准曲线上查出其抑菌圈直径的平均值所对应的标准浓度值，通过式(1)计算可得出样品中抗生素的含量：

式中：X——样品中杆菌肽的含量，IU/g；

c——从标准曲线上查出样液所对应的抗生素浓度，IU/mL；

m——最终试液所代表的禽肉试样的浓度，g/mL。

6.2.结果换算

    如果样品中杆菌肽含量的单位要采用mg/kg表示时，可将IU/g按照下述方法进行换算：

标准品中杆菌肽含量＝AIU/mg

样品中杆菌肽含量＝BIU/g

1 IU＝1/Amg＝1/A×10³μg ………………………………(2)

BIU/g＝B/A×10³μg/g＝B/A×10³mg/kg ………………………(3)

式中：A——标准品中杆菌肽含量的数值；

      B——依据式(1)计算所得到的样品中杆菌肽的数值。

7.低限、回收率的测定

7.1.测定低限

    本方法测定低限为0.025 IU/g。

7.2.回收率

    回收率的数据：杆菌肽添加浓度在0.025～0.100 IU/g范围内，回收率为74.8%～108.8%。

8.来源：

    SN  0295—93